1.Le séquençage de nouvelle génération (NGS) dans le diagnostic, le pronostic et la détection de la maladie résiduelle dans la leucémie aiguë myéloblastique (AML) - Peter Valk (Erasmus MC Rotterdam)

Aujourd'hui, le NGS est déjà utilisé presque partout pour déterminer le profil de mutation en cas d'AML. La quantification de la maladie résiduelle (MRD) par NGS, chez les patients AML en première rémission complète (CR1), a une valeur prédictive du risque de récidive, comme après une allogreffe de cellules souches. Le NGS visant la quantification de la MRD est donc très précieux, voire essentiel, tant lors du diagnostic avec détermination du pronostic que lors de la prédiction pendant les divers trajets de traitement.

L'implication du NGS dans l'établissement du diagnostic et du pronostic a été intégrée dans la dernière classification de l'AML du European Leukemia Net (ELN) (Must read: Döhner et al - Blood 2022) et son intérêt clinique a également été confirmé récemment par plusieurs groupes d'étude.

La technologie NGS a permis de constater que les mutations au moment du diagnostic persistent souvent pendant la CR, moyennant une haute VAF (Variant Allele Frequency - cf. remarque), compatible avec le concept d'hématopoïèse clonale (CH) préalable de longue durée. Ces mutations ont un impact majeur sur le risque de récidive précoce chez les patients AML plus jeunes (< 65 ans). D'autres mutations, principalement celles des voies de signalisation RAS, ont toutefois souvent disparu au moment de la CR. Illustration en modèle : les mutations au moment du diagnostic sont soit des mutations DTA (cf. ultra), soit des mutations non-DTA et seules ces dernières présentent une relation cliniquement significative avec le risque de récidive ! Un résultat anormal de NGS pour la MRD en CR, défini par ces mutations non-DTA, constitue un facteur prédictif indépendant de récidive et de moindre survie, tant avant qu'après une greffe de cellules souches (SCT) (pat. < 65 ans). Ce n'est pas le cas dans le groupe des patients plus âgés, de plus de 65 ans. Chez ces derniers, les mutations associées à la CH persistent d'ailleurs aussi souvent en CR ! Ces différences qualitatives et quantitatives de mutations entre les différentes catégories d'âge, tant lors du diagnostic que lors de la détection en CR, évoquent des différences au niveau de la biologie de leur maladie et de leur ontogenèse.

La quantification de la MRD par NGS permet aussi de démontrer l'impact des différences des traitements de consolidation entre les patients AML plus jeunes et plus âgés. Présenté sous la forme d'un modèle de travail : la détection de la MRD par NGS donne 2 groupes. Le groupe 1 comprend les sujets avec anomalies sans risque accru de récidive : mutations acquises sans signature proliférative ni avantage prolifératif ou mutations dites "initiatrices de leucémie" avec avantage prolifératif et mutations DNMT3a, TET2 ou ASXL1 (mutations DTA). Dans le groupe 2, ce risque de récidive est augmenté, notamment en cas de mutations transformantes et de mutations NPM1, FLT3, NRAS, KIT ou RUNX1. La détection de la MRD à mutation de type FLT3-ITD (avec "deep sequencing") prédomine spécifiquement sur tous les facteurs pronostiques actuels lors du diagnostic, et même sur les valeurs pronostiques de la détection de la MRD par NGS de NPM1 muté (ou avec cytométrie en flux multiparamétrique - NGF). Ce constat devient très pertinent dans le traitement de ces patients grâce aux nouveaux inhibiteurs de FLT3 !

La détection de la maladie résiduelle chez les patients AML, par NGS ciblé (et cytométrie en flux multiparamétrique, cytométrie en flux de nouvelle génération - NGF), fournit des valeurs pronostiques et prédictives additionnelles, majeures et indépendantes !

Remarque : "VAF is the percentage of sequence reads observed matching a specific DNA variant divided by the overall coverage at that locus. Because NGS provides a near random sample, VAF is thus a surrogate measure of the proportion of DNA molecules in the original specimen carrying the variant) (significant detection level at >5%?) "

2. Optical Genome Mapping - OGM" dans les cancers hématologiques - Barbara Dewaele (UZLeuven)

La cartographie optique du génome (OGM) est une alternative prometteuse aux procédures de mesure cytogénétique conventionnelle ("karyotyping, fluorescent in situ hybridisation, single nucleotide polymorphism array, reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification"), une affirmation qui a déjà été validée partiellement dans l'ALL, et récemment aussi dans l'AML. La méthode implique l'extraction d'ADN double brin de poids moléculaire ultra élevé (UHMW), l'étiquetage sur des motifs spécifiques, le transfert vers CHIP avec microcanaux, la lecture avec validation du résultat suivant des algorithmes qui alignent les molécules en cartographie du génome "consensus" et le crossmapping sur des profils de référence ("whole genome plots or views"), y compris "copy number alterations" (CNA) et variantes structurelles (SV) (Must read: Lestringant et al - Genes, Chromosomes and Cancer 2021).

Au niveau spécifique de l'ALL (Pre-B/TALL), l'OGM a été validée par rapport à la méthodologie classique chez 27 patients. Une série de conclusions positives ont pu être tirées. Les résultats étaient informatifs chez les 27 patients et la détection d'anomalies submicroscopiques a présenté une concordance parfaite avec la MLPA (cf. remarque). La correspondance s'est également avérée bonne avec le caryotypage et la FISH, moyennant e.a. l'identification de toutes les translocations récurrentes sans faux positifs, mais aussi avec complément en cas d'échec du caryotypage, avec affinement de valeurs seuils en cas d'anomalies structurelles, détection de partenaires de translocation (p. ex. de TCR), détection de fusions additionnelles (dont certaines potentiellement utiles sur le plan thérapeutique) et détection de chromothripsis . L'OGM a permis une classification du risque chez un plus grand nombre de patients, rapidement qui plus est, avec un résultat disponible en 1 à 2 semaines ! C'est très utile, y compris dans des protocoles d'études, grâce à une stratification rapide. Mais des points faibles ont également été constatés. Ainsi, la ploïdie ne s'est pas toujours révélée correcte et des petits (sous-)clones n'ont pas été décelés : la VAF a été estimée à 7,5 %. De même, des chromosomes iso- ou isodicentriques peuvent être mal interprétés. Des translocations d'un type spécifique (p. ex. rob (15;21)) n'ont pas été trouvés, alors qu'ils ont un important effet prédisposant dans l'ALL avec iAMP21. Le caryotypage conventionnel reste donc nécessaire pour résoudre les cas complexes ! De vastes connaissances en cytogénétiques sont toujours indispensables. La méthode FISH, notamment pour BCR::ABL1, reste elle aussi nécessaire. Des améliorations doivent également être apportées pour répondre à certaines questions ouvertes. Les valeurs seuils ne sont parfois pas exactes : si elles ne reposent pas sur un séquençage, quelles sont les valeurs significatives ? Il existe des anomalies structurelles dans la population générale : s'agit-il juste de polymorphismes ou sont-elles pathogènes ? La présence de grands nombres d'anomalies dans les cas complexes soulève aussi la question de la méthode offrant le plus de clarté : l'OGM ou le caryotypage ?

Les nouveaux résultats de l'OGM dans le diagnostic de l'AML fournissent également des données passionnantes ! Toutes les anomalies récurrentes typiques ont été détectées chez 15 patients AML. Quelques exemples : t(9;11) (KMTA12A::MLL T3) ; t(10;11)(NUP98::HHEY) ; cas à caryotype complexe, e.a délétion de 5q dans la tris.8. Des anomalies additionnelles ont par ailleurs été trouvées dans 6 cas : par exemple, un nouveau réarrangement de RUNX1, ou t(18;16)(q22.2;q23.2) et d'autres.

Il n'est pas invraisemblable que l'OGM supplante un jour d'autres méthodes, telles que la PCR ou la FISH ! Nous sommes par ailleurs curieux de voir ce que cela va donner dans d'autres cancers hématologiques, comme la CLL, ou dans le MDS !

Remarque : MLPA (Multiplex Litigation-dependent Probe Amplification) : technique utilisée en cytogénétique pour établir des amplifications de gènes, des délétions de gènes ou des hyperméthylations.

1.Le séquençage de nouvelle génération (NGS) dans le diagnostic, le pronostic et la détection de la maladie résiduelle dans la leucémie aiguë myéloblastique (AML) - Peter Valk (Erasmus MC Rotterdam)Aujourd'hui, le NGS est déjà utilisé presque partout pour déterminer le profil de mutation en cas d'AML. La quantification de la maladie résiduelle (MRD) par NGS, chez les patients AML en première rémission complète (CR1), a une valeur prédictive du risque de récidive, comme après une allogreffe de cellules souches. Le NGS visant la quantification de la MRD est donc très précieux, voire essentiel, tant lors du diagnostic avec détermination du pronostic que lors de la prédiction pendant les divers trajets de traitement.L'implication du NGS dans l'établissement du diagnostic et du pronostic a été intégrée dans la dernière classification de l'AML du European Leukemia Net (ELN) (Must read: Döhner et al - Blood 2022) et son intérêt clinique a également été confirmé récemment par plusieurs groupes d'étude.La technologie NGS a permis de constater que les mutations au moment du diagnostic persistent souvent pendant la CR, moyennant une haute VAF (Variant Allele Frequency - cf. remarque), compatible avec le concept d'hématopoïèse clonale (CH) préalable de longue durée. Ces mutations ont un impact majeur sur le risque de récidive précoce chez les patients AML plus jeunes (< 65 ans). D'autres mutations, principalement celles des voies de signalisation RAS, ont toutefois souvent disparu au moment de la CR. Illustration en modèle : les mutations au moment du diagnostic sont soit des mutations DTA (cf. ultra), soit des mutations non-DTA et seules ces dernières présentent une relation cliniquement significative avec le risque de récidive ! Un résultat anormal de NGS pour la MRD en CR, défini par ces mutations non-DTA, constitue un facteur prédictif indépendant de récidive et de moindre survie, tant avant qu'après une greffe de cellules souches (SCT) (pat. < 65 ans). Ce n'est pas le cas dans le groupe des patients plus âgés, de plus de 65 ans. Chez ces derniers, les mutations associées à la CH persistent d'ailleurs aussi souvent en CR ! Ces différences qualitatives et quantitatives de mutations entre les différentes catégories d'âge, tant lors du diagnostic que lors de la détection en CR, évoquent des différences au niveau de la biologie de leur maladie et de leur ontogenèse.La quantification de la MRD par NGS permet aussi de démontrer l'impact des différences des traitements de consolidation entre les patients AML plus jeunes et plus âgés. Présenté sous la forme d'un modèle de travail : la détection de la MRD par NGS donne 2 groupes. Le groupe 1 comprend les sujets avec anomalies sans risque accru de récidive : mutations acquises sans signature proliférative ni avantage prolifératif ou mutations dites "initiatrices de leucémie" avec avantage prolifératif et mutations DNMT3a, TET2 ou ASXL1 (mutations DTA). Dans le groupe 2, ce risque de récidive est augmenté, notamment en cas de mutations transformantes et de mutations NPM1, FLT3, NRAS, KIT ou RUNX1. La détection de la MRD à mutation de type FLT3-ITD (avec "deep sequencing") prédomine spécifiquement sur tous les facteurs pronostiques actuels lors du diagnostic, et même sur les valeurs pronostiques de la détection de la MRD par NGS de NPM1 muté (ou avec cytométrie en flux multiparamétrique - NGF). Ce constat devient très pertinent dans le traitement de ces patients grâce aux nouveaux inhibiteurs de FLT3 !La détection de la maladie résiduelle chez les patients AML, par NGS ciblé (et cytométrie en flux multiparamétrique, cytométrie en flux de nouvelle génération - NGF), fournit des valeurs pronostiques et prédictives additionnelles, majeures et indépendantes !Remarque : "VAF is the percentage of sequence reads observed matching a specific DNA variant divided by the overall coverage at that locus. Because NGS provides a near random sample, VAF is thus a surrogate measure of the proportion of DNA molecules in the original specimen carrying the variant) (significant detection level at >5%?) "2. Optical Genome Mapping - OGM" dans les cancers hématologiques - Barbara Dewaele (UZLeuven)La cartographie optique du génome (OGM) est une alternative prometteuse aux procédures de mesure cytogénétique conventionnelle ("karyotyping, fluorescent in situ hybridisation, single nucleotide polymorphism array, reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification"), une affirmation qui a déjà été validée partiellement dans l'ALL, et récemment aussi dans l'AML. La méthode implique l'extraction d'ADN double brin de poids moléculaire ultra élevé (UHMW), l'étiquetage sur des motifs spécifiques, le transfert vers CHIP avec microcanaux, la lecture avec validation du résultat suivant des algorithmes qui alignent les molécules en cartographie du génome "consensus" et le crossmapping sur des profils de référence ("whole genome plots or views"), y compris "copy number alterations" (CNA) et variantes structurelles (SV) (Must read: Lestringant et al - Genes, Chromosomes and Cancer 2021).Au niveau spécifique de l'ALL (Pre-B/TALL), l'OGM a été validée par rapport à la méthodologie classique chez 27 patients. Une série de conclusions positives ont pu être tirées. Les résultats étaient informatifs chez les 27 patients et la détection d'anomalies submicroscopiques a présenté une concordance parfaite avec la MLPA (cf. remarque). La correspondance s'est également avérée bonne avec le caryotypage et la FISH, moyennant e.a. l'identification de toutes les translocations récurrentes sans faux positifs, mais aussi avec complément en cas d'échec du caryotypage, avec affinement de valeurs seuils en cas d'anomalies structurelles, détection de partenaires de translocation (p. ex. de TCR), détection de fusions additionnelles (dont certaines potentiellement utiles sur le plan thérapeutique) et détection de chromothripsis . L'OGM a permis une classification du risque chez un plus grand nombre de patients, rapidement qui plus est, avec un résultat disponible en 1 à 2 semaines ! C'est très utile, y compris dans des protocoles d'études, grâce à une stratification rapide. Mais des points faibles ont également été constatés. Ainsi, la ploïdie ne s'est pas toujours révélée correcte et des petits (sous-)clones n'ont pas été décelés : la VAF a été estimée à 7,5 %. De même, des chromosomes iso- ou isodicentriques peuvent être mal interprétés. Des translocations d'un type spécifique (p. ex. rob (15;21)) n'ont pas été trouvés, alors qu'ils ont un important effet prédisposant dans l'ALL avec iAMP21. Le caryotypage conventionnel reste donc nécessaire pour résoudre les cas complexes ! De vastes connaissances en cytogénétiques sont toujours indispensables. La méthode FISH, notamment pour BCR::ABL1, reste elle aussi nécessaire. Des améliorations doivent également être apportées pour répondre à certaines questions ouvertes. Les valeurs seuils ne sont parfois pas exactes : si elles ne reposent pas sur un séquençage, quelles sont les valeurs significatives ? Il existe des anomalies structurelles dans la population générale : s'agit-il juste de polymorphismes ou sont-elles pathogènes ? La présence de grands nombres d'anomalies dans les cas complexes soulève aussi la question de la méthode offrant le plus de clarté : l'OGM ou le caryotypage ?Les nouveaux résultats de l'OGM dans le diagnostic de l'AML fournissent également des données passionnantes ! Toutes les anomalies récurrentes typiques ont été détectées chez 15 patients AML. Quelques exemples : t(9;11) (KMTA12A::MLL T3) ; t(10;11)(NUP98::HHEY) ; cas à caryotype complexe, e.a délétion de 5q dans la tris.8. Des anomalies additionnelles ont par ailleurs été trouvées dans 6 cas : par exemple, un nouveau réarrangement de RUNX1, ou t(18;16)(q22.2;q23.2) et d'autres.Il n'est pas invraisemblable que l'OGM supplante un jour d'autres méthodes, telles que la PCR ou la FISH ! Nous sommes par ailleurs curieux de voir ce que cela va donner dans d'autres cancers hématologiques, comme la CLL, ou dans le MDS ! Remarque : MLPA (Multiplex Litigation-dependent Probe Amplification) : technique utilisée en cytogénétique pour établir des amplifications de gènes, des délétions de gènes ou des hyperméthylations.